Biyoplastik (PHB) ve Önemi

Günlük  hayatımızın  bir  parçası  olan  plastik  ürünler,  kanıtlanmış  pek  çok dezavantajlarına  rağmen; kolay şekil alma, elastikiyet, nakliyede  rahatlık ve ucuzluk gibi  nedenlerden  dolayı  tercih  edilen  malzemeler  olmuşlardır.  Ancak,  plastiğin “kullanılıp-atılabilme” özelliği, şimdiden çevre kirliliği açısından en büyük sorunlardan biri  haline  gelmiştir. Her  yıl  birkaç  yüzbin  ton  plastik  denize  atılır  ve  okyanusta birikir.  Dünyada  biriken  yıllık  plastik miktarı  ise  25 milyon  ton  kadardır.  Bu nedenle,  son  yıllarda  plastikler,  ekolojik  problemlerin  kaynağı  olarak  karşımıza çıkmaktadırlar.

PHB Sentezi

PHB Sentezi

90’lı  yıllarda  100  milyon  tonun  üzerinde  üretilen  ve  2000  yılında  bu  rakamın  150 milyon  ton  olduğu  tahmin  edilen  sentetik  polimerlerin,  yerine  kullanılabilecek  başka bir malzeme türü olmadığı sürece, çevre ve insan sağlığına getireceği yükler gittikçe artacaktır.

Petrolden  elde  edilen  sentetik  polimerler,  plastik  atık  olarak  doğaya  terk edildiklerinde,  toprakta  uzun  süre  parçalanamadığından  çevre  kirliliğine  ve  toksik madde  birikimine  neden  olmaktadırlar.  Bu  nedenle,  biyolojik  olarak  parçalanabilen polimerlerin  üretimi  önem  kazanmış  ve  petrol  kökenli  polimerlerin  yerini  almalarına yönelik çalışmalar artmıştır.

1970’li  yıllardaki  petrol  krizinden  sonra  petrol  fiyatlarının  artmasına  da  bağlı  olarak, petrol kökenli polimerlere alternatifler aranmış ve 1976 yılında, İngiltere’deki Imperial Kimya Endüstrisi  (ICI),  bakteriyel  fermentasyonla  üretilen  poli-Beta-hidroksibütirat’la (PHB) ilgili araştırmalara başlamıştır.

Günümüzde, PHB  gibi  biyoparçalanabilir,  yenilenebilir,  biyouyumlu  ve  doğayla  dost plastiklerin bakterilerde sentezi ve polimer kimyasındaki uygulamaları  ile  ilgili alınan olumlu sonuçlarla biyoplastiklere olan ilgi her geçen gün artmaktadır.

Çeşitli  araştırıcılar,  biyoplastik  üretiminde  bakteriyel  biyoplastiklerin,  gelecek uygulamalar  için  kullanılabileceğini  bildirmektedirler.  Avantajlı  özelliklerinden yararlanmak  ve  endüstriyel  PHB  üretimi  yapmak  için  uygun  suşların  tespiti araştırmalarında,  Alcaligenes,  Pseudomonas,  Rhizobium,  ve  Bacillus  cinsi  gibi bakteri  grupları  da  yer almaktadır.  Çalışmalarda,  bu  cinslere  ait  vejetatif  bakteri hücrelerinin,  diğer  metabolik  ürünlerin  yanısıra  poli-β-hidroksibütirat  gibi  metabolik materyaller de depoladıkları bildirilmiştir.

Poli-β-hidroksibütirat ‘ın (PHB) Tanımı ve Tarihçesi

Bakteriyel  plastik  veya  biyoplastik  de  denilen  ve  petrokimyasal  plastiklerin  neden olduğu çevresel kirliliğe alternatif olarak ortaya çıkan poli-β-hidroksialkanatlar (PHA), geleneksel  plastik  potansiyeline  sahip,  mikrobiyal  olarak  üretilen  polimerlerdir. PHA’ların bakterilerde,  insandaki  yağ  veya bitkilerdeki nişasta gibi  rol oynadığı bildirilmektedir.

Bir  çok  çeşidi  bulunan PHA’lar,  linear,  uzun,  3-hidroksi  yağ  asidi monomerlerinden ibaret,  aktif  mikrobiyal  polyesterlerdir.  Bunlar  içinde  yer  alan  poli-Beta-hidroksibütirat  (PHB), PHA’ların  en  yaygın  ve geniş  kapsamlı olarak  çalışılan  tipidir ve polimerin bu sınıfına ticari ilginin doğmasına neden olan PHA’dır. İlk  kez,  Lemoigne  tarafından,  1920’li  yıllarda,  topraktan  izole  edilen  Bacillus megaterium bakterisinde bilinmeyen bir materyalin parçalanması  sonucu  rastlanılan 3-hidroksi  bütirik  asit,  poli-3-hidroksibütirat  homopolyesteri  (PHB)  olarak tanımlamıştır.  Sonraki  30  yılda  PHB  polimerine  olan  ilgi  giderek  artmış  ve  1958 yılında Macrae ve Wilkinson Bacillus hücresi  içinde PHB sentezi ve parçalanmasını yönlendiren hücre  içi şartları ve mekanizmasını araştırmışlardır. PHB  ile ilgili araştırmalarla, termoplastik ve elastomerik bir materyal olduğu anlaşılan polimer, patentli ürünlere dönüşmüştür.

Biyoparçalanabilir,  termoplastik  bir  materyal  olan  PHB’ın,  petrol  türevli  plastiklerin yerini almak  için  ticari olarak üretimi çalışmaları, 1960’lı yıllarda başlamış, ancak  ilk endüstriyel üretimi 1970’li yıllarda gerçekleşmiştir. Üretilen  ilk  ticari ürün BIOPOL adıyla patentlenmiştir.

Bu  yıllarda  İngiltere’de  Imperial  Kimya  Endüstrisi  (ICI)  birçok  bakteriyel  türü, potansiyel  PHB  üretimi  açısından  incelemiş  ve  endüstriyel  üretimde,  hücre  kuru ağırlığının  %  90’ı  üzerinde  PHB  biriktiren  Alcaligenes  eutrophus  bakterisini kullanmaya  başlamıştır.  Daha  sonraki  yıllarda  PHB  ile  ilgili  çalışmalar Pseudomonas,  Azotobacter,  Hydrogenomonas,  Chromatium,  Bacillus  vb.  bakteri cinsleriyle  devam  etmiş;  PHB’ın  fiziksel  ve  kimyasal  özellikleri,  moleküler  ağırlığı, ekstraksiyon metodları, metabolizması,  iç-dış parçalanması gibi çok yönlü özellikleri incelenmiştir.

PHB’ın Genel Özellikleri

Hücre  içi  depo  granülü  şeklinde  sentezlenen  ve  biriktirilen  PHB,  yapısında  kısa zincirli β-hidroksi yağ asitleri  içeren, prokaryotların membranla çevrili hücre  içi depo maddesi olup, tekrarlanan hidrofobik birimlerden oluşan uzun bir polimerdir.

[-O–CH–CH2–C-] n
.         |         ||
.       CH3     O

D(-)-3-hidroksi bütirik

asit polimerinin kimyasal yapısı

Yan  zincirinde  bir  metil  grubu  bulunan,  optikçe aktif D(-)-3-hidroksi bütirik asidin makromoloküler bir polimeri olan PHB’ın genel  formülü  (C4H6O2)n şeklindedir. (n) sayısı 35 000 gibi yüksek bir sayıya ulaşabilir.

Hücrede  bir  redoks düzenleyicisidir. Faz  kontrast  veya elektron  mikroskobu  (EM)  kullanıldığında,  bakteriyel hücrelerde  PHB  granülleri kolaylıkla gözlenebilir. PHB, genellikle küre şeklinde olup, her granül çap olarak 100-800 nm  arasındadır.  Bunlar  2-4  nm  kalınlığında  üniter  olmayan  bir  membranla çevrilidir. Granüllerin yaklaşık % 98’i PHB, % 2’si ise protein içermektedir.

Yapılan  EM  çalışmalarında,  granülün  içte  yer  alan  bir  merkezi  kısım  ve  birkaç tabakalı  membranla  çevrilmiş kabukdan  oluştuğu  bildirilmiştir.  PHB’lar, polipropilen gibi petrol  türevli yaygın plastiklere benzer materyal özellikler gösterirler. Ancak, bir termoplastik olan PHB’ın sertliği, polietilene kıyasla dört misli fazladır. Hücre  içinde sıvı,  atmosferde  katı  halde  olan  PHB,  organik  çözücü  ile  hücreden özütlendiğinde kristalize olur.

Katı  ama  kırılgan  bir  materyal  olan  PHB’ın  erime  sıcaklığı,  157-188  ˚C  olup,  bu, polimerin  termal  olarak ayrıştığı  sıcaklığa  yakındır.  PHB  termoplastik  olduğundan preslenip şekil verilebilir.

PHB’ın, UV ışımalarına dirençli olduğu ancak, asit ve baz uygulamalarına karşı zayıf dirence  sahip  olduğu  bildirilmektedir.  Ayrıca,  polimerin  su  ve  hava  geçirmez  oluşu hidrolitik  parçalanmaya  karşı  direnç  sağladığından  PHB’ın  kullanım  olanakları genişlemektedir.

Polimerin molekül  ağırlığı,  özellikle  bakterinin  türüne  bağlı  olmakla  birlikte,  büyüme koşulları ve hücrenin yaşam döngüsündeki yerine göre de değişebilir. PHB molekülünün  ağırlığının  60.000–2.000.000 Da  arasında  değiştiği  bildirilmektedir. Taidi  ve  arkadaşları,  PHB’ın  moleküler  ağırlığının,  karbon  kaynağı  olarak metanol  kullanıldığında  Methylobacterium  extorquens  bakterisinde  0,6X106 Da, Alcaligenes  eutrophus  bakterisinde,  1,1X106 Da;  süksinat  kullanıldığında  ise M. extorquens  bakterisinde  1,7X106 Da  ve  A.  eutrophus  bakterisinde  1,6SX106 Da moleküler ağırlığında olduğunu bildirmişlerdir. PHB  biyosentez  genlerinin,  kromozomda  veya  Plasmid  DNA’da  lokalize  olduğu bildirilmektedir.  PHB’ın,  biyolojik  parçalanabilirliği,  biyolojik  uyum  yeteneği  ve toksik  olmayışı  sayesinde  endüstriyel  uygulamalarda  kolayca  kullanılabileceği bildirilmektedir.

PHB Oluşum Şartları ve Tayini

Araştırmacılar,  PHB’ın  birçok  mikroorganizma  tarafından,  uygun  olmayan  üreme koşullarında  oluşturulduğunu  ve PHB  birikiminin  genellikle,  fazlaca  karbon kaynağı varlığında, ancak büyüme  için gerekli nitrojen kaynağı, oksijen ve esansiyel elementler  (N,  P,  S,  Mg,  K,  Fe  vb.)  gibi  besleyici  maddelerin  eksikliğinde gerçekleştiğini bildirmektedirler.

Yapılan  araştırmalarda,  büyüme  ve  PHB  biriktirimi  arasında  yakın  bir  ilgi  tespit edilmiştir.  Buna  göre,  bakteri  gelişiminin  eksponansiyel  fazında  PHB  birikimi artmakta,  geç  eksponansiyel-erken  durgun  dönemde  ise  maksimum  düzeye ulaşmaktadır.  Büyüme  sırasında  bölünme  olmayan  hücrelerde  de,  PHB miktarının yüksek oranda arttığı bilinmektedir. Sporlu bakterilerde PHB birikiminin spor  oluşumundan  hemen  önce  olduğu  ve sporulizasyonda  enerji  kaynağı  olarak kullanıldığı belirtilmektedir. Yapılan bir çalışmada, Rhizobium bakterilerinde, kültür ortamının asitleşmesine bağlı olarak hücre ölümünün arttığı ve PHB  içeriğinin buna bağlı olarak düştüğü bildirilmiştir.

UV  spektrofotometrik  olarak  tayini  yapılabilen  PHB,  hücreden  ayrıldığında,  sülfürik asitle krotonik aside dönüştürülerek, 235 nm dalga boyundaki absorbansı ölçülebilir.

PHB’ın  hücrede  teşhisi  ve  konsantrasyonunun  belirlenmesinde 1H  NMR  ve  Gaz Kromatografisi analizi ve FTIR spektroskopi yöntemi kullanılabilmektedir. Canlı  bakteri  hücresi  içerisindeki  PHB  depo  granüllerinin  tespit edilmesi  için  geniş olarak kullanılan metotlardan biri de lipofilik boyalarla boyamadır. Bu amaçla Nil Blue A, Sudan Black B ve Sudan III gibi bazı florosan boyalar kullanılabilir.

PHB Sentezi

Polimerin  biyosentezi,  monomerlerin  oluşumu  ve  birleştirilmesi  gibi,  iki  enzimatik aşama  gerektirir.  Üretim  seviyesi,  zincir  uzunluğu  ve  oluşan  kopolimerlerin kompozisyonu, bu enzimlerin performansına bağlıdır.

Hücre  içinde  PHB  birikiminin  artması  için,  yüksek  NAD(P)H,  yüksek  asetil-CoA  ve düşük  serbest  CoA  düzeyinin  olması  gerekmektedir.  Bu  şartların  oluşumu, mikroorganizmalara  göre  değişmekle  beraber  genelde  nitrojen,  potasyum,  sülfür veya oksijenin sınırlandırılması gibi büyümeyi sınırlandırıcı etkenlere bağlıdır.

En  kapsamlı  karakterize  edilen  polimer  olan  PHB’ın  biyosentezi,  üç  değişik  enzim tarafından  katalize  edilen,  üç  enzim  reaksiyonundan  oluşmaktadır.  İlk reaksiyon,  iki Asetil-CoA molekülünün,  β-ketoaçil CoA  tiolaz  tarafından, Asetoasetil CoA’ya dönüştürülmesini  içermektedir.  İkinci  reaksiyon, Asetoasetil CoA’nın NADPH bağlı  bir  Asetoasetil  CoA  dehidrogenaz  tarafından,  R-3  Hidroksibütiril  CoA’ya indirgenmesidir.  Son  olarak,  R-3  Hidroksibütiril  CoA  monomerleri  PHB  sentaz tarafından,  PHB’a  polimerize  olmaktadır.  Asetil  CoA  ve  3-Hidroksibütiril  CoA,  PHB sentezindeki  ara  araçlardır.  Asetat  ve  PHB,  Asetil  CoA’nın  konsantrasyonunu arttırabilir  ve  hücrede  3-Hidroksibütiril  CoA  ve  3H’ın  sentezini  bundan  dolayı kolaylaştırır.

Prokaryot hücrelerde PHB’ın hücre içi sentezi için başlangıç bileşiği, Asetil CoA’dır. Substrat ve Asetil CoA’nın hücre içi konsantrasyonunun artmasıyla oluşan koşullar, sentezde pozitif bir etkiye sahiptir. Bu basitleştirmektedir  Enzimatik olarak katalizlenen reaksiyonun düzenleyici mekanizma idaresi altında olması bunun nedeni olarak gösterilmektedir.

PHB  oluşumunda  ilk  basamağı  katalizleyen,  β-ketoaçil  CoA  tiolaz  (phbA  geni  ile kodlanan),  açil-CoA+asetil-CoA’daki  substratların  tiolitik  ayrılmasını  içeren  enzim ailesinin  bir  üyesidir. Yüksek  ökaryotlardan, mayalara  ve  prokaryotlara  kadar  doğal olarak bulunurlar.

Asetoasetil  CoA  dehidrogenaz  (phbB  geni  ile  kodlanan),  bir  R-3-hidroksiaçil  CoA dehidrogenazdır  ve  3-hidroksibütiril-CoA’yı  asetoasetil-CoA’ya  çeviren  ikinci basamağı katalizler. PHB biyosentez yolunda,  tiolaz ve dehidrogenaz enzimleri tarafından katalizlenen reaksiyonlar, polimerizasyon için monomer sağlar. Oluşan bu R-3 Hidroksibütiril CoA monomerleri  ise, PHB sentaz  tarafından  (phbC  ile kodlanan) PHB’a polimerize edilir.

PHB  granülleri  ile  sentaz  enzimi  polimerizasyonu  arasındaki  ilişki  yıllardır bilinmektedir.  Sınırlı  karbonlu  ortamda  gelişme  sırasında,  sentaz  enzimi  çözünmüş formda  oluşmaktadır.  Nitrojen  azlığında  ise  PHB  sentaz  oluşmaktadır.  Çözünmüş sentazın bu şartlar altında hızla tükenmesi PHB granülleri ile ilişkilidir.

PHB Sentezinin Kinetik Model Gösterim Şeması

PHA sentezinin anahtar enzimleri olan ve 3-hidroksiaçil-CoA substratlarının PHA’lara dönüşümünü  katalizleyen  PHA sentazların,  54  farklı  çeşidi  tayin  edilmiş  ve klonlanmıştır  Alt  ünite  kompozisyonu  ve  substrat  özgüllüğüne  bağlı olarak  PHA sentazlar üç çeşit olarak ele alınır. I. Sınıf PHA sentazlar Alcaligenes eutrophus’dan, II.  Sınıf  PHA sentazlar  Allochromatium  vinosum  ve  III.  Sınıf  PHA  sentazlar Pseudomonas  aeruginosa’da  bulunan enzimlerdendir.  Caulobacter  crescentus ‘dan izole edilen 2019 Nükleotid içeren ve 673 aminoasidi kodlayan PHB sentaz geni, phaC, yaklaşık 73 kDa olan moleküler ağırlığı ile bugüne kadar tanımlanan en büyük PHA sentaz enzimidir.

Miyake  ve  arkadaşları,  asetil-CoA’nın  asetilfosfata  dönüşümünü  sağlayan fosfotransasetilaz ezimi ile ilgili yaptıkları çalışmada, bu enzimin açığa çıkardığı asetil fosfatın  PHB  sentaz  aktivatörü  gibi  rol  oynadığını  ve  PHB sentezini  aktive  etttiğini bildirmişlerdir.  Ancak,  bu  enzimdeki  azalmanın  da  PHB  sentezi  izyolundaki  asetil-CoA substratını  arttırabileceğini  ve  sonuç  olarak  PHB  birikiminin  yükselebileceğini rapor etmişlerdir.

PHB  sentezinde  iş  gören  enzimlerin  farklı  hücre  içi  şartlara  uyum  sağlayabilmeleri, PHB  üreten mikroorganizmaların  geniş  bir  çeşitliliğe  sahip  olmalarına  neden olmaktadır. Ancak, her ne kadar PHB biriktirimi bir çok prokaryotik mikroorganizmada görülür  ise  de,  β-keto  açil  CoA  Thiolaz,  Asetasetil  CoA  Dehidrogenaz  ve  PHB Sentazın enzimatik mekanizmaları ile ilgili biyokimyasal araştırmalar sadece bunların iki doğal  yapımcısı olan Zooglea  ramigera ve Alcaligenes eutrophus  da  yapılmıştır. Örneğin, Bacillus megaterium PHB’ın  ilk olarak  izole edildiği ve  tanımlandığı bakteri olmasına  karşın,  henüz  biyosentez  mekanizması  tam  olarak  karakterize edilememiştir.

PHB ‘ın Biyolojik Parçalanabilirliği

PHB,  biyolojik  parçalanabilirliği  nedeniyle,  bir  kez  kullanılıp  atılan  eşyaların üretiminde büyük avantajlar sağlar.

PHB’ın  en  önemli  özelliklerinden  biri,  toprak  ve  insan  vücudu  vb.  yerlerde,  toksik ürünler meydana getirmeksizin  tamamen parçalanabiliyor olmasıdır. PHB’ın aerobik ortamdaki parçalanma ürünleri  karbondioksit  ve  su; anaerobik ortamda parçalanma ürünü ise metandır.

PHB’ın parçalanma süresi bir kaç aydan (anaerobik), bir kaç yıla (denizsuyu) kadar, katkı  maddesi  ile  ayarlanabilir.  Parçalanmada  nitrojen  oksidi  oluşmaması,  çevre korunmasında  önemlidir.  Parçalanan  biyoplastik  bitkilerin  gelişmesini  olumlu  yönde etkilemektedir. Polimerin  parçalanmasında,  bakteri, mantar,  ve  yüksek organizmalar  biyolojik  faktörler  olarak;  hidroliz  ve  oksidasyon  kimyasal  faktörler olarak;  güneş  ışığı,  ıslanma  ve  mekanik  aşınma  ise  fiziksel  faktörler  olarak  etki etmektedir.

PHB  ve  onun  kopolimerleri  bakteriler,  funguslar  ve  algler  gibi  mikroorganizmalar tarafından belirli  çevre şartlarında, nispeten kısa bir peryot  içerisinde  tamamen C02 ve  enerjiye  dönüştürülerek  parçalanabilmektedir.  Tamamen  parçalanma  için gereken  zaman  ve  biyoparçalanma  oranının,  kalınlık,  yüzey  özellikleri,  ısı  ve çevredeki mikrobiyal nüfus gibi etkenlere bağlı olarak değiştiği bildirilmiştir.

Nguyen  ve  arkadaşları  (46),  PHB,  PHV  ve  P(HB-HV)  (polihidroksibütirat-co-hidroksivalerat) kopolimerlerinde, ısıya bağlı (170-200 °C) parçalanmayı araştırdıkları çalışmalarında, reaksiyonun ilk birkaç saatindeki tabakalaşmayı, ısı etkisiyle erimenin takip  ettiğini  bildirmişlerdir.  Araştırmacılar,  ısı  etkisiyle  PHB  parçalanmasının hızlandığını belirterek, bunun polimerlerin oligomer  formlarının krotonat son grupları ile  ilgili olduğunu bildirmişlerdir.Mergaert ve arkadaşları ise, PHB’ın  toprakta ve steril  tampon  çözeltide  parçalanmasını  araştırdıkları  çalışmada,  her  iki  ortamda  da molekül  ağırlığının  düştüğünü,  ancak  kütle miktarındaki  azalmanın  sadece  toprakta görüldüğünü  ve  bunun  toprak  çeşidine  bağlı  olarak  değiştiğini  bildirmişlerdir.  Buna göre,  kütle  azalmasındaki  en  yüksek  düzeye  killi  toprakta  ulaşılmıştır.  Bazı araştırmacılar  da,  topraktaki  P(HB-HV)  biyoparçalanırlık  yüzdesinin  toprağın  çeşidi ve içerdiği su miktarına bağlı olarak değiştiği bildirmektedirler.

PHB’ın,  karbon  ve  enerji  kaynağı  olarak  bakteriler  tarafından  kullanılabilmesi  için depolimerize olması gerekmektedir. Depolimerizasyon sonucu oluşan monomerik 3-hidroksibütirik  asit  ve  dimer  yapı  birçok  organizma  için  kullanılabilir  substratlardır.

PHB’ın depolimerizasyonu  için kullanılan enzimler hücre  içi veya hücre dışı enzimler olabilir.  PHB’ı  parçalayan  hücre  içi  enzimler  Bacillus  megaterium ve  Alcaligenes eutrophus’da saptanmıştır.

Hücre  içi  depolimerazların,  hücre  dışı  depolimerazlardan  farklı  fonksiyonları  vardır. Hücre  içi  depolimerazlar,  hücre  içinde  hareketli  ve  kristalize  olmayan,  doğal  PHB elastomerlerini  parçalarlar.  Dönüşüm  sonrasında  kristalize  olan,  denature  edilmiş PHB ise hücre dışı depolimerazlar tarafından hidrolize edilir. Bununla  beraber,  hücre  dışı  PHA  depolimerazlarla  hücre  içi  depolimerazlar arasındaki yapısal farklılık nedeniyle, bozulmamış, doğal PHA granüllerinin hücre dışı PHA depolimerazlarla direkt olarak parçalanamadığı bildirilmektedir.

PHA  sentaz  ve  PHA  depolimeraz  aktivitelerinin,  granüllerin  membran  protein tabakası  ile  yakın  ilişkili olduğu ve membranı parçalayıcı veya  tahrip edici metodlar olan  PHB  ekstraksiyon  metodlarının,  sentaz  aktivitesinin  kaybına  ve depolimerizasyona hassasiyetin artmasına yol açtığı bildirilmektedir.

PHB’ın hücre içi parçalanması, PHA depolimeraz enziminin PHB’ı hidrolize etmesi ile başlar.  R-3-hidoksibütirat  dehidrogenaz  ve  asetoasetil-CoA  sentaz,  R-3-hidroksi bütirat monomer ve dimerlerinin oluşumuna neden olur.

A.  eutrophus’da  PHB’ın  in  vivo  depolimerizasyonu  sonucu  oluşan  3-hidroksi  bütirik asit monomerlerinin,  hücredeki  düşük  –R-(-)-3-hidroksi  bütirik  asit  dehidrogenaz  ve yüksek PHA depolimeraz aktivitesi ile oluşturulduğu bildirilmiştir.

Ancak,  Gribel’in  (1968)  B.  megaterium  ‘la  yaptığı  çalışmada  PHA  sentaz  ve  PHA depolimeraz enzimlerinin granüle bağlı olmayıp, çözünmüş halde olduğu bildirilmiştir. Burada, granül dış membranının bir proteini, depolimeraz aktivitesini engeller. Buna göre,  çözücü  ile  granül  yapısının  tahrip  olması  üzerine  polimer  hidrolizindeki  artış açıklanabilir.

PHB’ın,  hücre  dışı  parçalanması  depolimeraz  tarafından  katalizlenir.  Bu  enzimlerin aktiviteleri  polimerin  kompozisyonuna,  amorf  veya  kristalin  olmasına,  yani  fizik formuna,  örneğin  bölümlerine  ve  en  önemlisi  çevresel  koşullara  bağlı  olarak değişebilmektedir.

Alcaligenes  faecalis  ‘de  PHB  depolimeraz  enziminin  etkinliğinin  kristal  yapının kalınlaşması ile azaldığı bildirilmiştir.

Abe  ve  Doi,  (R)-3-hidroksialkanoik  asitlerle  koployester  oluşturan  (R)-3-hidroksibütirik  asitlerin  enzimatik  parçalanması  üzerine  yaptıkları  çalışmada, Alcaligenes  faecalis  T1  PHB  depolimeraz  enzimi  varlığında,  kopolyesterin  erozyon oranının  hem  kristaliniteye  hem  de  örneğin  tabaka  kalınlığına  bağlı  olduğunu  ve enzimatik  parçalanmanın  monomer  birimlerin  karbon  sayısındaki  artışla  arttığını bildirmişlerdir.

Hidroliz  reaksiyonunun ürünü  iz halindeki D(-)-3-hidroksibütirat monomeriyle esasen bir dimerdir. Dimer ve monomerler hücrelerce içeriye alınır. Hücre içinde bir hücre içi Beta-hidroksibütirat dimer hidrolaz tarafından dimer katalizlenir ve daha sonra oluşan monomer ara metabolik yol izlerine dahil edilir. Örneğin, Alcaligenes faecalis ve Pseudomonas  lemoignei  ‘den  elde  edilen  hücre  dışı  PHB  depolimeraz  enzimi, PHB’dan  3-Hidroksibütirik  asit  dimer  ve  trimer  yapılarını  serbestleştirmiştir.  Yine Bacillus  megaterium  ile  yapılan  çalışmalarda  da  PHB’ın  parçalanması  sonucu  3-Hidroksibütirik asit trimer yapılarının hücrede biriktirildiği görülmüştür. Charles  ve  arkadaşları,  Rhizobium  meliloti  ‘de  PHB’ın  parçalanma  iz  yolunu etkileyen genlerin kromozom ve mega plazmidde yerleştiğini tespit etmişlerdir.

PHB ‘ı Parçalayan Mikroorganizmalar

PHB  ‘ın parçalanmasında,  topraktaki birçok mikroorganizma görev alır. Aerobik ve  anaerobik  PHB  parçalayan  bakteriler  dışında  funguslar  da,  bu  yıkıma katılmaktadır. Bunlar toprak, kompostlar, aerobik ortamlar, anaerobik bataklıklar, göl-deniz  suları  ve  hava  gibi  çeşitli  ekosistemlerden  izole  edildiklerinden  PHB’ın  bu ortamlarda  parçalanabildiği  bildirilmiştir.  Topraklarda  yer  alan  parçalayıcı organizmaların  bazı  Gram  negatif  mikroorganizmalar,  Gram  pozitif  basiller, streptomycetler ve küf mantarları olduğu bildirilmiştir.

PHB depolimeraz enzimi salgılayan bakteri ve mantarlar, PHA’ları suda çözünebilen oligomer  ve monomerlere  hidrolize  ederler.  Aerobik  ve  anaerobik  PHA  parçalayan mikroorganizmaların  bu  yetenekleri  PHA  kristalleri  veya  filmleri  üzerinde  yapılan çalışmalarla gerçekleştirilir.

Molitoris  ve  arkadaşları,  bir  çalışmalarında,  Comomonas  sp.,  Pseudomonas lemoignei  ve  P.  fluorescens  tarafından  polihidroksialkonatların  yüzey  tabakasının bakteriyel  olarak  parçalandığını  bildirmişlerdir.  Bakteriyel  hidroliz  sırasında polimerdeki  morfolojik  değişikliklerin  Taramalı  Elektron  Mikroskobu  (SEM)  ile araştırıldığı  çalışmada,  parçalanan  örneklere  bakıldığında  hidrolizin  yüzeyden başladığı görülmüştür.

Denitrifikasyon yapan bazı bakteriler, PHB’ı anaerobik olarak parçalayabilmektedirler. Khan  ve  Hiraishi,  aktif  çamurdan  izole  ettikleri  yeni  bir  denitrifikant kemoorganotrof  bakterinin  PHB  ve  kopolimeri  P(HB-HV)’ı  aerobik  ve  anaerobik şartlarda parçalayabildiğini bildirmişlerdir. Denitrifikasyon bakterilerinin PHB ve P(HB- HV)’ı parçalamaları onları elektron vericisi olarak kullanmaları ile mümkün olmaktadır. Stieb  ve Schink,  denizin  anoksoik  kısmından  izole  ettikleri,  zorunlu  anaerobik, Gram  negatif  bir  bakteri  olan  Ilyobacter  polytropus’un  3-hidroksibütiratı,  bütirata fermente ettiğini tespit etmişlerdir.

Çevreyle dost, biyoparçalanabilir plastiklerin kullanım ve tüketimlerinin artması doğal çevredeki birikim ve biyoparçalanabilir potansiyellerinin iyice bilinmesi gereğini ortaya çıkarmıştır.  Bu  amaçla,  polimerleri  parçalayıcı mikroorganizmalar  ve mekanizmalar üzerinde yapılan çalışmalar da her geçen gün artmaktadır. Bu çalışmalardan birinde, Sei  ve  arkadaşları,  PHB  parçalayan  mikroorganizmaların  hızlı  ve  duyarlı  bir şekilde tespitine yarayan, bir PCR primer seti ve gen probu dizayn etmişler ve bunun çalışmalarında  kullandıkları  57  PHB  parçalayan mikroorganizmadan  47’si  üzerinde olumlu sonuç verdiğini bildirmişlerdir.

PHB ‘ın Yenilenebilme Özelliği

PHB’ın  biyolojik  yapısı  ve  biyolojik  yıkıma  uğraması  kadar  önemli  olan,  onun yenilenebilen kaynaklara dayalı üretilebilmesi gerçeğidir. Bir doğal materyal olan bu polyester  bakteriyel  orijinlidir  ve  gerçekten  bir  çok  mikroorganizma,  bu makromolekülü  parçalama  yeteneğindedir.  Bunun  yanı  sıra,  petrokimyasal termoplastlar gibi, geri dönüştürülebilir bir biyoparçalanma gösterirler.

PHB’ın  fermentatif üretimi,  şekerler  ve  yağ asitleri gibi  tarımsal ürünlerin  karbon  ve enerji kaynağı olarak kullanılabilmesine bağlıdır. Bu,  tarımsal kaynaklı karbondioksit ve  sudan  meydana  gelmektedir  ve  bunların  biyoparçalanabilir  PHB’a  çevriminden sonra,  yıkım ürünleri  yine  karbondioksit  ve  sudur. Dolayısıyla, bazı uygulamalar için  biyoparçalanma  kritik  iken,  PHB’lar,  azalmakta  olan  fosil  yakıtların  yerine yenilenebilen bileşikler olarak dikkat çekmektedirler.

PHB ‘ın Kullanım Alanları

PHB,  kolay  şekil  alma  ve  parçalanabilme  özellikleri  nedeniyle  daha  çok  paketleme malzemesi  olarak  kullanılmaktadır. Ancak,  biyouyum  yeteneklerinin  de  olması, implantasyon maddesi olarak kullanımını da her geçen gün arttırmaktadır.

Özellikle  PHB  ve  kopolymer  poli-β-hidroksibütirat-co-polihidroksivalerat  P(HB-HV), gıda  ve  kozmetik alanındaki paketleme maddeleri,  tarım,  kişisel  temizlik araçları  ve biyomedikal  ürünler  gibi  alanlarda  çok  geniş  potansiyel  uygulamalara  açıktır. Hidroksiasit  uzun  yan  zincirli  PHB’lar  basınca  duyarlı  yapışkanlar  olarak kullanılmaktadır.  PHB,  lateks  gibi  kağıt  örtüler,  günlük  krem  öncülleri  üretimi  ve gıdalardaki unun dağılımını sağlayan ajanların yapımını sağlayabilirler.

Biyouyumlu olan PHB monomerleri insan vücudunda bulunan doğal metabolit olması nedeniyle, polimer vücutta sadece çok hafif bir immünolojik cevap oluşmasına neden olur.  Bu  özelliğinden  dolayı  PHB  insanlarda  ilaçların  kontrollü  salınımı  için  test edilmiştir. Böyle çalışmalarda ilaç, PHB den yapılmış bir hap içine sıkıştırılmış ve ağız yoluyla hastalara verilmiştir.

PHB’ın vücut  içinde biyolojik parçalanması yavaştır.  İnsan vücudu PHB depolimeraz enzimi  içermez. Bu özelliğinden dolayı da PHB  cerrahi dikişler, protezler ve  iğneler gibi cerrahi malzemelerin yapımında kullanılmıştır.

Yapılan  çalışmalar,  tekstil  sanayinde,  PHB’dan  yararlanılabileceğini  göstermiştir. Alcaligenes  eutrophus  ‘dan  izole  edilen  genlerin  pamuk  bitkisine  (Gossypium hirsutum  L.Cv  DP50)  aktarılması  sonucu,  transgenik  pamuğun  lif  lümenleri  içinde PHB üretimi  sağlanmıştır. PHB granülleri  sayesinde  yüksek  ısı  kapasitesi  ve düşük termal  geçirgenliğe  sahip  olan  transgenik  liflerin  tekstil  sanayi  uygulamalarında avantaj sağladığı bildirilmiştir.

Biyobozunur plastiklerin paketleme, gıda, tıp, eczacılık ve tarımdaki kullanım alanları
aşağıda sıralanmıştır:

-Paket filmleri, poşetler, torbalar, gıda muhafazasında kullanılmak üzere tepsiler ve
çeşitli kaplar,

-Şampuan ve meşrubat şişeleri, karton süt kutularının iç yüzey kaplamaları,

-İlaç,  tablet,  insektisit,  herbisit  ve  gübrenin  uzun  sürede,  belli  hızda  salıverilmesi
için biyoparçalanır taşıyıcılar,

-Bir kereye mahsus kullanılan traş bıçağı, çatal, bıçak, tabak gibi mutfak kapları ve
bebek bezleri,

-Cerrahi pens, ameliyat ipliği, eldiven, önlük ve maske,

-Kemik değiştirilmesi ve cerrahi plakalar,

-Pansuman sargısı,

-Kan damarı değiştirilmesi,

-Bitki sulama boruları, bitki yapraklarının kaplanması,

-Pi (izoelektrik nokta) özelliklerinden yararlanılarak kemik büyütülmesi ve tedavisi,

-Kiral bileşenler üretimi için başlatıcı materyaller,

-Taze balık, peynir, et  ve et ürünleri,  kurutulmuş ürünler,  orta nemli gıdalar,  yağlı tohumlar, kurutulmuş pastacılık ürünleri, cipsler, şekerlemeler gibi gıdalarda nem ve oksijene  karşı  koruma  veya  parlaklık  sağlama,  aroma  kaybını  önleme  amacıyla kullanım.

PHB ‘ın Ziraatta Kullanım Alanları

PHB,  özellikle  toprakta  biyoparçalanma  gerektiren  uygulamalar  için  çok  uygundur. Örneğin,  film  şeklinde  kaplamada  alüminyum  folyo  gibi  kullanılmıştır.  Benzer  bir uygulama  olarak  ekin  sulaması  için  PHA’lardan  yapılacak  oluklar  kullanılabilir.  Bu durumda hasat mevsiminin  sonunda bunların  tarladan  toplanması gerekmeyecektir. Ayrıca  bunlar  tohum  kapsüllendirilmesinde,  fide  taşımacılığında  örnekleri  korumak için, gübre yada pestisitlerin kontrollü salınımı  için plastik  kılıflar olarak kullanılabilir. Kış mevsiminde  buğdayı  topraktaki  bir  zararlıdan  korumak  gerektiğinde,  uygun  bir insektisit PHB granülü  içine alınabilir  ve  sonbaharda buğdayla  birlikte  toprağa ekilir.

Topraktaki bakteriler PHB granülünde kolonize olmaya başlayacak ve PHB yaklaşık bir  haftalık  inkübasyon  periyodundan  sonra  insektisidi  serbest  bırakmaya başlayacaktır. Bu süre kimyasalların olmadığı bir çevrede tohumların çimlenmesi için yeterli  zamandır.  Bitki  büyümesi  ve  mikrobiyal  büyüme  insektisidin  salınımıyla beraber  geç  sonbahara  kadar  sürecektir.  Yaklaşan  kışla  beraber  toprağın  sıcaklığı düşecek, mikrobiyal  büyüme  oranı  azalacak  ve  böylece  daha  az  insektisit  serbest bırakılacaktır.  Böylece  aktif  kimyasallar  atılmadan  toprakta  zararlının  aktivitesi  tüm kış  boyunca  düşecektir.  İlkbahar  ve  toprak  zararlısı  geri  geldiğinde  yüksek  toprak sıcaklığı  PHB  pelletlerinin  daha  fazla  mikrobiyal  parçalanmasını  teşvik  edecektir. Böylece  diğer  zararlılar  için  insektisit  mevcut  olacak  ve  bu  güzel  bir  “biyolojik geribesleme” mekanizması ortaya çıkaracaktır.

PHB’ın Veterinerlikte Kullanım Alanları

Veteriner hekimliğinde ilaçların salınımı için biyolojik parçalanabilen bir matriks olarak PHB’ın  birçok  kullanım  alanı  vardır.  Polimer  özellikle  sığırların  rumeninde  çok  iyi parçalanabilmektedir.  Bu  konuda  çok  tipik  bir  örnek  olarak  bir  yıl  boyunca hayvanların  kurtlanmasını  önlemek  için  antihelmitik  ilaç  içeren  PHB’ın  büyük kapsülleri yapılmıştır. Çiftçiler, ilacı, yönetmelikte önerilen dozda iki ayda bir sığırların etrafına bırakarak onların parazitlenmesini engellemişlerdir.

PHB’ın Tıpta Kullanım Alanları

PHB ve kopolimerleri çeşitli ürünlerin yapısında önemli bir potansiyele sahip olmakla birlikte, son zamanlardaki en  ilginç uygulamalar biyolojik uygunluğu ve maliyetinden dolayı  tıp ve eczacılık alanlarındadır. Bu alanlardaki gelişmeler de oldukça  ilerlemiş safhadadır. Hayvan dokularına PHB girişi yüksek şiddette toksik etki yapmadığından; vücutta  absorbe  edilebilen  protez  aletlerin,  yapay  kan  damarlarının  ve  cerrahi dikişlerin yapımında PHB’ın kullanılması birçok araştırıcıya kılavuzluk etmiştir.

PHB  ve  kopolimerlerinin  hayvan  dokularına  implante  edildiğinde  onların  biyolojik olarak parçalanabildiği görülmüş ve bu alanda hem  tıbbi, hem de eczacılık amaçları için de PHA’ların kullanımına olan  ilgi artmıştır. Sonuçta, veterinerlikte ve  insanların ilaçla  tedavisinde  teropatik  bileşiklerin  kontrollü  olarak  salıverilmesi  için  PHA’lar kullanılmıştır.

Polimerin uygulama alanları onun özelliklerine bağlı olarak, doğrudan kullanılmasının yanında  depolimerizasyon  ürünü  olan  D(-)-3-hidroksibütirik  asit  monomerinin kullanımı da oldukça ilginç ve yaygındır. Özellikle PHB’ın parçalanma ürünü olan D-(-)-3-hidroksibütirik asit bu alanda çok önemlidir. Çünkü bu tüm yüksek organizmalarda bir  ara  metabolit  bileşiğidir;  lipit  metabolizmasının  ürünü  olarak  bulunur.  İnsan kanının normal bir ögesi olan 3-hidroksibütirik asit, belirli dokularda özellikle de beyin ve kalp dokusu için bir enerji kaynağı olarak hizmet eder ve bunun beyin gelişiminde rol alan aminoasitlerin prekürsörü olarak  fizyolojik bir  role sahip olduğu saptanmıştır.

D-(-)-3-hidroksibütirik asitin diabetiklerin kan serumunda anormal konsantrasyonlarda var  olan  keton  yapılarından  biri  olarak  rol  oynadığına  dair  birçok  bilgiler  de  vardır. Çalışmalar, D(-)-3-hidroksibütirik asidin damar  içi veya ağızdan. karbon sağlanması için  kullanılabileceğini  ve  daha  yaygın  olarak  kullanılan  glikoz  yerine  bazı  klinik avantajlara  da  sahip  olduğunu  göstermiştir.  İlginç  olan  bir  diğer  çalışmada  da,  çok şişman  (obese)  hastalar, 14 gün  boyunca  teropatik açlık altında  tutulduklarında hiç açlıktan şikayet etmemişlerdir.

Kronik  osteomyolitis  hastalarının  tedavisinde  biyoparçalanabilir,  biyouyum  ve  kemik geçirgenliğini  sağlayan  piezoelektrik  özellikleri  bulunan  P(HB-co-HV)  kopolimeri kullanılarak,  bu  kopolimerden  hazırlanan  kapsüller  içine  antibiyotik  konmuştur. Tavşanın  tibia  kemiği  içine  yerleştirilen  kapsülün,  ilaç  salınımının  etkinliğinin araştırıldığı  çalışmada,  kopolimerin  antibiyotik  taşıyıcı  bir  sistem  olarak kullanılabileceği bildirilmiştir.

PHB’ın hastanelerde cerrahi sargılar ve eldivenler  içinde bir yağlayıcı madde olarak veya  ince  toz  formunda kullanılması  oldukça  ilginçtir.  Ayrıca  biyolojik parçalanabilirliğiyle  ilgisi  olmaksızın  yarada  kalabilecek  olan  bu  PHB  sargılarındaki fibrillerin,  normal  sargılardakilerden  çok  farklı  delik  yapısına  sahip oluşu bir avantaj da  sağlar.  Hastalar  içinde  unutulan  pamukların,  birçok  ülkede  hukuk  davalarının başında geldiği düşünülürse bu avantaj oldukça önemlidir.

Yüksek  teknolojiyle  PHB’ın  geleceğe  yönelik  kullanım  alanlarından  biri  de;  uygun ölçülerde  su  geçirmez  bir  tüp  formunda  düzenlenen  çok  ince  fibrillerden meydana gelen  kan  damarı  veya  bir  vasküler  aşı  gibi  kullanılmasıdır.  Bu  aşı  vücut  içinde gelişen  yeni  dokular  için  geçici  bir  yapı  iskelesi  olarak  rol  alabilir  ve  sonuçta  doğal dokular  tarafından  tamamen  eski  haline  gelebilir.  Bu,  vücudun  doğrudan  tepkisini alan sentetik damarlardaki engelleme ve pıhtı oluşum problemini  tamamen yok eder.

Metal  yapı  iskeleleri  yerine  emilebilen  maddelerin  kullanılmasının  en  önemli avantajları,  bunların  metabolize  olabilmeleri,  operasyon  sonrasında  istenmeyen cerrahi değişimlerin engellenmesi ve oluşan damarların iskeletinin sağlanabilmesidir. Ayrıca  yapı  iskelelerinin  emilmesi  sayesinde,  ilaç  serbestleştirici  farmakolojik ajanların vücuda dahil edilmesi mümkün olur.

PHB  ve  kopolimerlerinin  önemli  bir  özelliği  de  polipeptitler,  polinükleotitler, polisakkaritler ve proteinler gibi piezoelektrik polimer olmasıdır. PHB ve kopolimerleri polivinilidon,  florit  polimeri  gibi  kesikli  piezoelektrisite  göstermektedir.  Poliviniliden florit  polimerinin  filmleri  kemiği  elektriksel  stimülasyon  ile  kuvvetlendirebildiği  ve kemiğin  onarıldığı  bilinmektedir.  Bu  durumda  bir  kemik  kırığını  sabitleyen  levhalar benzer mekanik  özelliklere  sahip  takviyeli  bir  PHB  karışımından  yapılırsa,  uyarılan kemik  büyür  ve  gelişir.  Böy1e  bir  kemik  kırığındaki  plaka  biyolojik  olarak parçalanabilir  ve  vücut  tarafindan  bulunduğu  yerde  yavaşça  emilebilir.  Bu  sırada kemik  de  kaynar  ve  plakayı  uzaklaştırmak  için  ikinci  bir  operasyona  gerek  kalmaz.

PHB’ın Kimyasalların Eldesinde Kullanılması

(R)-(-)-hidroksi karboksilik asitler, büyük oranda antibiyotikler, vitaminler, aromatikler ve  feromonlar  gibi  ince  kimyasalların  sentezi  için  kiral  yapı  blokları  olarak kullanılabilirler.  Yeni  bileşenlerin  sentezi  için,  kiral  bir  merkeze  sahip  olan  bu bileşikler, iki fonksiyonal grup (OH, COOH) içerirler.

Organik kimyada asimetrik sentez işlemi çok önemlidir ve bu alanda enantiomerik saf bileşikler  revaçtadır.  D-(-)-3  -hidroksibütirik  asit  de  bu  gruba  ait  olduğundan,  saf maddelerin  geniş  miktarlarda  eldesinde  PHB’ın  kullanılması  önem  kazanmaktadır. Doğada  en  yaygın  form  olan D-(-)-konfigürasyonuna  sahip  olan  bu  optik  izomerler, bulundukları  ortamda  kiral  merkezleriyle  diğerlerinden  daha  kuvvetli  bağlanma özelliğine  sahip  olduğundan  kromatografide  kullanılabilir.  Ayrıca  bunların  yağ/su emülsiyonları için, emülsifikasyon ajanı olarak kullanımı da mümkündür.

Birçok  ilaç, sadece bir kiral  formda aktiftir ve D-(-)-3-hidroksibütirat böyle bileşiklerin organik  sentezinde  bir  çimento  bloğu  gibi  kullanılır.  D-(-)-3  hidroksibütirat monomerinden,  Hindistan  mısırındaki  haşaratın  bir  seks  hormonu,  bir  balarısı hormonu, Cerambycidae familyasından bir böceğin koruyucu substratı ve güzel koku olarak  S-citronellol  gibi  6  saf  kimyasalın  organik  olarak  sentezlendiği  belirtilmiştir.

PHB’ın  Paketleme  Filmleri  ve  Tek  Kullanımlık  Malzemelerin  Yapımında Kullanılması

PHB ve kopolimerlerinin mekanik özellikleri polietilen, polipropilen vs. gibi bazı  ticari plastiklere  benzediğinden  termoplastik  poliesterlerdir.  PHB  daha  kırılgan  olması  ve zayıf  çözgen  dayanıklılığı  dışında,  polipropilenle  benzer  özelliklere  sahiptir. Düşük  su buharı geçirgenliği gibi besin paketleme endüstrisi açısından önemli olan bir özelliği  ile de, düşük yoğunluklu polietilene benzemektedir. Kopolimerler  ise daha  esnektir  ve  daha  düşük  erime  sıcaklığına  sahip  olduğundan,  preslenmiş ürünlerin  imalatı  için  daha  kullanışlıdırlar.  Diğer  taraftan  sadece  belirli  bakteriler tarafindan üretilen uzun  yan  zincirli  (C4-C12) polimerler, daha düşük erime noktaları ve  cam geçirgenlik  sıcaklığına  sahiptir. Bu materyaller  lastik  benzeridir  ve gerçekte bir termo-elastomerdir.

PHB,  kopolimerleri  kadar  iyi  bir  şekilde  preslenebilir,  biçimlendirilebilir,  lif  haline dönüştürülebilir,  filmleri  yapılabilir  ve  klorine  edilmiş  polietilen  gibi  diğer  sentetik polimerlerle heteropolimer yapımında kullanılabilir.

PHB  kalıp  yapımı,  sıkıştırılmış  film  ve  bazı  fibrillerin  geliştirilmesinde  kullanılmıştır. Yapılan paket  filmleri mükemmel bir gaz bariyeri özelliğindedir. 25 µm kalınlığındakibir  PHB  filmi  45  cm3/m2/gün’lük  bir  oksijen  geçirgenligine  sahiptir.  Düşük  olan  bu oksijen  geçirgenliğinden  dolayı  gıda  maddelerinin  paketlenmesinde  PHB  filmleri rahatlıkla kullanılabilir. Bu PHB filmleri polipropilen filmleri kadar güçlüdür, fakat polietileter  fitalat  kadar  dayanıklı  değildir.  Oysa  cam  takviyeli  PHB  kalıpları  naylon benzerlerine göre daha sert ve dayanıklıdır. Fakat bunların da sıcaklığa dayanıklılığı mühendislik açısından  iyi değildir. Ancak birçok plastik, cam-fiber dolgusu  ilavesiyle kuvvetlendirilebilmiştir.

PHB  mükemmel  olan  gaz  bariyer  özelliğinden  dolayı,  film  şeklinde  kaplamacılıkta kullanılmıştır. Kanada’daki Hamur ve Kağıt Araştırma Enstitüsü, Montreal’deki Mc Gill Üniversitesi  ile PHA  laktik  üreten  bir  firma  olan Ecole Politeknik  ve  Imperial Kimya Şirketi  arasındaki  ortak  bir  projeyle  PHB,  kaplanmış  kağıt  ve  yüksek  kalitede  film yapmak  için  kullanılmıştır.  Bu  kaplanmış  kağıtlar  tamamen  biyolojik  olarak parçalanabilmektedir ve  ticari olarak, kaplanmış kağıtlarda geri dönüşüm daha kolay olmuştur.

Biyolojik  olarak  parçalanabilirliğinden  dolayı  tek  kullanımlık  ürünlerin  üretimi  için PHA’lara yönelinmiştir. Bu alanda Imperial Kimya Şirketi ve bunun yan kuruluşu olan Marlborough  Biopolimers  gibi  şirketler  PHA’ların  araştırılması  ve  geliştirilmesinde aktif olarak  rol almıştır. PHA polimerine bu  iki şirket  ticari  isim olarak BIOPOL adını vermiştir ve 1970’ li yıllarda ilk ticari prosesleri patentlemişlerdir. Imperial  Kimya  Şirketi,  kadınlara  mahsus  hijyenik  ürünler,  tek  kullanımlık  çocuk bezleri  ve  geri  dönüşümü  güç  olan  plastik  filmler  gibi  tek  kullanımlık  mutfak malzemeleri  için PHA’ın  potansiyel bir pazar olduğunu önceden görmesine  rağmen PHA’ın  ilk  ticari  kullanıcısı  Almanya’da  Wella  kozmetik  şirketidir.  Bu  şirket  PHA’ı enjeksiyonla  şişe  şeklinde  kalıplamış  ve  saç  şampuanlarını  paketlemek  için kullanmıştır.

Polipropilene fiziksel özellikleri yüzünden çok benzeyen PHB, polipropilenden yapılan yıkanabilir kaplar, kırıştırılabilen paketler ve  ipler gibi pek çok ürünün yapımında da kullanılabilmektedir.

PHB Üretiminde Kullanılan Substratlar

PHB  ve  çeşitli  PHA’ların  üretimi  için  kullanılan  substratlar  özellikle  karbon  kaynağı açısından  bakıldığında,  glukoz,  sükroz  ve  yağ  asitleri  ile  alkanlar  ve  kloroalkanoik asitler  gibi  kimyasal  bileşenlerdir. Ayrıca,  bütirik  ve  pentatonik  asit, propiyonik  asit,  4-hidroksi  hegzanoik  asit,  L-Laktat  gibi  karbon  kaynakları  kullanımı da denenmiştir.

PHB  ve  kopolimerlerin  kompozisyonu,  kullanılan  karbon  kaynağına bağlı olarak değişebildiği, ancak bu dağılımın tesadüfi olabileceği de söylenmiştir. Ramsay  ve  arkadaşları,  Alcaligenes  latus,  Alcaligenes  eutrophus,  Bacillus cereus,  Pseudomonas  pseudoflava,  Pseudomonas  cepacia  ve  Micrococus halodenitrificans  bakterilerini  glukoz  ve  propiyonik  asit  bulunan  ortamda geliştirdiklerinde,  nitrojeni  sınırlandırılmış  şartlar  altında  P(HB-co-HV)  kopolimeri ürettiklerini  tespit etmişlerdir. Araştırıcılar, kopolimer  içindeki HV oranının propiyonik asit miktarına bağlı olarak değiştiğini de saptamışlardır.

Chen  ve  arkadaşları,  hücre  kuru  ağırlığının  %85’i  kadar  PHB  biriktirdiğini bildikleri  A.  latus  DSM  1122  suşunun  PHV  üretimi  üzerine  yaptıkları  çalışmada, ortama Na-valerat eklediklerinde sadece PHV, oysa propiyonat ve asetatı aynı anda ilave ettiklerinde PHB ve PHV elde edildiğini tespit etmişlerdir.

Amonyum  klorür, amonyum asetat, balık peptonu amonyum  sülfat vb. azot içeren kaynaklardan da PHB verimini arttırıcı çalışmalarda yararlanılmaktadır. Durner  ve  arkadaşları,  Pseudomonas  oleovorans  ile  yaptıkları  çalışmada, oktonat  ve  amonyum  içeren  besiyerini  farklı  C/N  oranlarında  hazırlamışlar  ve  C/N oranı  arttığında  PHA  birikimini  yükseldiğini  ve  bunun  nitrojenin  sınırlanmasından kaynaklandığını bildirmişlerdir

Pseudomonas pseudoflava  ile yapılan bir çalışmada da, besiyerinde karbon kaynağı olarak glukoz ve ksiloz kullanılırsa %PHB verimimin %22, arabinoz kullanılırsa %17 olabileceği  bildirilmiştir.  Araştırıcılar,  arabinoz  ve  ksiloz  içeren  ortamda,  PHB biriktirilmesinin  son  aşamasında  nitrojen  sınırlandırıldığında, PHB miktarının düştüğünü de bildirmişlerdir.

Page  ve  arkadaşları,  Azotobacter  vinelandii  UWD  suşunu,  glukoz  ve  balık peptonu  içeren  besi  ortamında  geliştirdiklerinde  %80  PHB  verimine  ulaşmışlardır Rhizobium  meliloti’nin  fruktozlu  ortamda  üretildiğinde  yüksek  miktarda  PHB  depo ettiği bildirilmiştir.

Alcaligenes  eutrophus’da  Tanaka  ve  arkadaşları,  L-Laktatlı  besiyerinde %  55 PHB birikimi tespit etmişlerdir.

A.eutrophus’un  polietilen  glikol  veya  polisakkaritlerden  kopolimerler  ürettiği  ve  bu kopolimer  kompozisyonu  ve  moleküler  ağırlığının  yapılan  müdahalelerle  kontrol edilebileceği  bildirilmiştir. Yine  aynı  bakterinin  gklukoz,  propiyonik  asit veya 4-hidroksi bütirik asit ya da bütirolacton kullanıldığında P(3HB-co-3Hv-co-4HB) ürettiği bildirilmiştir.

Biyoparçalanabilir  plastiklerin  imali  için  potansiyel  hammadde  olan  PHB’ın, fermentasyon olayı  ile kütle üretiminin geliştirilmesi yoluna gidilmiştir. Fermentasyon olayı,  kesikli,  yarıkesikli  ve  sürekli  fermentasyon  olarak  gerçekleştirilebildiği bildirilmiştir.

PHB’ın Ucuz Üretimi

PHB  oluşumu  için  kullanılan  şeker  substratının  fiyatının,  PHB  üretiminin  ticari başarısında sınırlayıcı faktörlerden biri olduğu ve polimer üretiminin her bir tonu için, 3  ton glukoz kullanılması gerektiği bildirilmektedir. Kullanılan glukozun, maliyeti yükseltmesi  sonucunda  üretilen  PHB’ın  kg  fiyatı  15-30  US  Dolar  arasında değişmektedir.

Polimerin  kullanım  sınırlarını  belirleyecek  olan  maliyet  fiyatını  düşürmek  için, rekombinant  türler  üzerinde  çalışmalar  yapılmasının  yanısıra,  farklı  ve  ucuz  karbon kaynakları kullanarak yüksek PHB verimi elde eden suşlar üzerinde araştırmalar da yapılmaktadır.

Düşük  fiyatlı biyoplastik üretimi  için melas, ksiloz, arpa ve soya atıksuları ve  peynir  altı  suyunun kullanılması  araştırılmaktadır.  Ucuz  PHB üretimi  için  kullanılabilen melas,  bakteriler  için  karbon  kaynağı  olmasının  yanı  sıra, içerdiği  vitaminler  ve  mineraller  ile,  büyüme  faktörü  kaynağı  olarak  da kullanılmaktadır.

Page, Azotobacter vinelandii UWD suşunun şeker pancarı melası gibi kompleks karbon kaynaklarında da yüksek PHB verimine sahip olduğunu saptamıştır.

Page,  iyi  bir  polimer  üreticisi  olan  A.  vinelandii  UWD  suşunun,  ucuz  karbon kaynağı olan şeker pancarı melasında üretildiğinde, glukozun üçte biri maliyete mal olduğunu  ve  eğer  ortama  valerat  ilave  edilirse  PHV  kopolimerinin  oluştuğunu bildirmiştir.  Şeker  pancarı  melasının  tanımlanmamış  büyümeyi  uyarıcı  faktörler içerdiğini  söyleyen Page,  şeker  pancarı melasından  polimer  üretimini  arttırmak  için ortama azot bileşenleri ilave edilebileceğini de belirtmiştir.

PHB’ın  pratik  uygulamalarında  üretim  fiyatlarının  indirgenmesi  için  daha  ekonomik kültür  ortamları  araştırılırken  substrat  maliyetinin  düşürülmesinin  yanı  sıra, karbondioksidin dönüştürülüp ucuz yoldan PHB üretilebilmesi için, Cyanobacter ile de çalışmalar yürütülmektedir.

Ucuz karbon kaynakları ve hatta peyniraltı suyu gibi atıklardan PHB üretimi yapılarak verimin  artttırılması  amaçlanmaktadır. Ahn  ve  arkadaşları,  rekombinant E.  coli kullanarak peynir altı suyundan yüksek PHB verimi alındığını bildirmişlerdir. Kim ise çalışmasında, yine  rekombinant E. coli’yi peynir altı suyunda geliştirmiş ve %20 PHB verimi; Azotobacter chrococcum’u ise nişasta içeren besi ortamında geliştirerek, oksijeni sınırlandırılmış şartlar altında %46 PHB verimi elde etmiştir.

Mikroorganizmalarda PHB Üretimi

Prokaryotik  mikroorganizmaların  geniş  bir  kısmı  tarafından  sentez  edilebilen  PHB toprak,  deniz  ve  tatlısu,  bunların  sedimentleri  gibi  farklı  çevresel  örneklerden  izole edilen, çok sayıda heterotrofik ve ototrofik aerobik,  fotosentetik anaerobik bakteriler Actinomycetesler, cyanobakteriler, anaerobik, yağ asidi okside eden bakteriler, Gram negatif ve Gram pozitif bakteriler tarafından depolanabilmektedir. PHB,  özellikle  Alcaligenes  sp.,  Azotobacter  sp.,  Bacillus  sp., Pseudomonas  sp.  ve çeşitli  toprak mikroorganizmaları  gibi  bir  çok mikroorganizma  tarafından  oluşturulur.

Ticari  olarak  biyoplastik  üretiminde  İmperial  Kimya  Şirketi  öncelikle  metilotrofik bakterileri ve Azotobacterleri kullanmış, ancak daha sonra PHB üretim seviyesi daha yüksek olan Alcaligenes eutrophus bakterisi ile devam etmiştir.

Alcaligenes ve Azotobacter Cinsi Bakterilerde PHB üretimi

Yapılan  çalışmalarda,  Alcaligenes  eutrophus  bakterisinin,  fruktozu  karbon  kaynağı olarak  kullanarak  hücre  kuru  ağırlığının  %  80’inden  fazlasını  PHB  olarak biriktirebildiği ve Alcaligenes eutrophus’un glukozu kullanabilen mutantlarının da PHB  üretiminde  kullanılabileceği  bildirilmektedir.  Alcaligenes  latus  gibi  bu  cinse  ait diğer  türler  de  birçok  karbon  kaynağını  kullanarak  yüksek  PHB  verimi  sağlarlar. Ortamdaki  C/N  oranının  artışının  polimer  sentezini  kolaylaştırması  nedeniyle, Alcaligenes  türlerinde  PHB  üretiminin  kinetiğinde  büyüme  fazını  takiben,  azot kaynağının sınırlı hale getirilmesinin oldukça belirgin bir depo  fazı oluşturduğu rapor edilmiştir.

Beaulieu ve arkadaşları, Alcaligenes eutrophus DSM 545 suşunda %3 glukoz ve farklı  amonyum  kaynakları  ile  seker  kamışı  melasında  PHB  verimini  araştırdıkları çalışmalarında, en iyi büyüme ve PHB üretiminin amonyum sülfat  içeren besiyerinde olduğunu  bildirmişlerdir.  Araştırmada,  bakteri  tarafından  metabolize  edilemeyen melas,  karbon  kaynağı  olarak  değil  sadece  büyüme  aktivatörü  olarak  kullanılmıştır. Optimal büyüme ve PHB üretiminin %0,3 melas oranında sağlandığı rapor edilmiştir. Çalışmada ulaşılan en yüksek PHB Verimi ise %26 seviyesindedir.

Tanaka ve arkadaşları ise, geliştirdikleri iki aşamalı fermentasyon metodunda, A. eutrophus’un  Lactococcus  lactis’in  ksilozdan  üretmiş  olduğu  L-Laktat  içeren besiyerinde büyütülürse, % 55 oranında PHB biriktirdiği tespit etmişlerdir.

Kim  ve arkadaşları, A. eutrophus NCIMB 11599 suşunun  farklı zamanlarda ve amonyumu  sınırlı  şartlarda incelemişlerdir.  Araştırmacılar,  en  yüksek  hücre yoğunluğu sırasında sınırlanan amonyum oranının PHB veriminde %76’lık bir artışa sebep olduğunu bildirmişlerdir.

Borman  ve  arkadaşları,  Azotobacter  beijerinckii  bakterisinin  kasein  pepton, maya özütü, kasamino asit ve üre gibi organik azot kaynaklarının glukoz veya sükroz gibi  karbon  kaynaklarıyla  kombine  edildiğinde,  azot  sınırlamasına  gerek  kalmadan %50’den  fazla  PHB  üretebileceğini  bildirmişlerdir.  PHB’ın  büyüme  ilişkili  şartlardan etkilendiğini ve özellikle kazein pepton içeren besiyerinde büyümenin durgun fazında en  yüksek  PHB  üretim  değerine  ulaştığını  söylemişlerdir.  Çalışmada,  oksijeni sınırlandırılmış şartlarda PHB üretiminin arttığı da vurgulanmıştır.

Farklı  Azotobacter  türlerinin  PHB  verimi  üzerine  yapılan  çalışmalardan  birinde,  A. vinelandii  UWD  suşunun  glukoz,  fruktoz,  sakkaroz,  maltoz  gibi  rafine  karbon kaynakları ile şeker kamışı melası, şeker pancarı melası, mısır şurubu , malt ekstraktı gibi kompleks karbon kaynaklarında yüksek PHB verimi elde edildiği bildirilmiştir.

Page  ve  Knosp,  A.  vinelandii  UWD  suşunun,  glukoz  ve  yanısıra  amonyum asetat  veya  N2  içeren  besi  ortamında  24  saatlik  kültür  sonucunda,  hücre  kuru ağırlığına  oranla  sırasıyla  %65  ve  %75  PHB  verimine  ulaştığını  bildirmişlerdir. Araştırmacılar,  bu  suşda  polimer  üretiminin  oksijen  sınırlandırılmasına  bağlı olmadığını,  glukozun  PHB’a dönüşümünün  etkinliğinin  oksijeni  sınırlı  kültürlerde arttığını bildirmişlerdir.

Nişasta  gibi  ucuz  substratlardan  PHB  üretiminin  araştırıldığı  bir  çalışmada Azotobacter chrococcum kullanılmış ve farklı oksijen konsantrasyonları altındaki PHB verimleri  araştırılmıştır.  Oksijen  sınırlamasının  PHB  verimini  arttırdığı  belirtilen araştırmada, PHB veriminin %20’den %46’ya ulaştığı bildirilmiştir.

Bacillus ve Pseudomonas Cinsi Bakterilerde PHB Üretimi

Çeşitli  araştırıcılar,  biyoplastik  üretiminde  Bacillus  biyopolimerlerinin  potansiyel gelecek  uygulamalar  için  kullanılabileceğini  bildirmektedirler.  Ayrıca,  Bacillus ‘ların melas  gibi  ucuz  substratlarda  hızlı  bir  şekilde  büyüdükleri;  yüksek  sıcaklık  ve yüksek  osmotik  basınca  dayanıklı  oldukları  ancak,  hücre  duvarı  yapılarının  kalın oluşu  nedeniyle  PHB  ekstraksiyonu  zor  olduğu  bildirilmiştir.  Yine  de  avantajlı özelliklerinden  yararlanmak  ve  endüstriyel PHB  üretimi  yapmak  için  uygun  suşların tespiti araştırmaları devam etmektedir.

Bacillus  türlerinde  PHB  sporulasyon  için  hücre  içi  enerji  rezervi  olarak  işlev görmektedir. Örneğin, B. cereus’da spor oluşumundan hemen önce PHB birikiminin maksimum  oranda  olduğu  ve bakterinin  sporulasyon döneminde PHB’ın  kullanıldığı bildirilmektedir.  Benoit  ve  arkadaşları,  B.  thuringiensis  üzerinde  yaptıkları çalışmada, durgun  fazdaki sporulasyon sırasında PHB’ın  tüketilmeye başladığını ve PHB’ın spor şekillenmesi sırasında enerji kaynağı olarak kullanıldığını bildirmişlerdir. Kato ve arkadaşları yaptıkları çalışmada, B. megaterium ‘da 3-Hidroksibütirik asit trimer  yapılarının  geç  eksponansiyel  fazda  biriktirildiğini,  durgunlaşma  ve  ölüm fazında ise parçalanma sonucunda en yüksek düzeye ulaştıklarını söylemişlerdir.

Lach  ve  arkadaşları,  filamentli,  küçük  sferik  hücreler  oluşturan B. megaterium PV302  mutantında,  PHB  miktarının  hücre  kuru  ağırlığının  %16’sı  kadar  olduğunu tespit  etmişlerdir.  Atasal  suşla  karşılaştırıldığında,  mutantta  sporulasyon  ve gelişmede bozukluklar görüldüğü bildirilmiştir.

Yapılan  araştırmalarda  bazı  Bacillus  suşlarının  hücre  kuru  ağırlığının  %50  den fazlasını PHB şeklinde biriktirebildiği bildirilmektedir. Chen  ve  arkadaşları,  zenginleştirilmiş  besiyerinde  büyütülen  Bacillus bakterilerinde  hücre  kuru  ağırlığına  göre  %5-20  arasında  PHB  biriktirildiğini bildirmektedirler.

Kato ve arkadaşları da kendi izole ettikleri B. megaterium B-124 suşunun hücre kuru ağırlığının %20 sinin PHB olduğunu bildirmişlerdir. Dave ve arkadaşları, aktif çamurdan  izole  edilen  10  Bacillus  suşundan  özellikle  birinin  %70  PHB  verimliliğe sahip olduğunu söylemişlerdir.

Mercan  ve  Beyatlı,  10  adet  B.  sphaericus  suşunun  PHB  üretimlerini  tespit ettikleri çalışmalarında, PHB üretiminin %5,00-%25,88 arasında bulmuşlardır. Ancak özellikle  üretimi  en  yüksek  olan  bazı  suşların,  %0,2  beef  ekstrakt  içeren  besi ortamında  yüzde  verimlerinin %32,50’ye  kadar  çıktığını  bildirmişlerdir.  Labuzek  ve Radecka, B. cereus UW85 suşunu nitrojeni sınırlandırılmış şartlarda geliştirmişler ve PHB verimini %9 olarak tespit etmişlerdir.

Wu ve arkadaşları, melaslı besiyerindeki oksijen şartlarını değiştirerek yaptıkları çalışmada,  oksijen  miktarındaki  azalmanın  sporulasyona  neden  olduğunu  ve  PHB üretiminin  düştüğünü;  nitrojen  ve  fosforun  oranının  karbona  göre  düşük  olduğu besiyerlerinde  ise PHB üretiminin arttığını bildirmişlerdir. Bacillus sp. Jma5 suşunun, PHB verimini %25-35 olarak tespit etmişlerdir.

Bacillus  ‘ların amilaz ve proteinaz enzimlerinin varlığı nedeniyle gıda atık sularından faydalanabileceğini  bildiren  Law  ve  arkadaşları,  aktif  çamurdan  izole  ettikleri Bacillus suşlarını arpa ve soya atık suyunda geliştirerek PHB verimlerini araştırmışlar ve suşlardan HF-1’in atıklardan %19,22 HF-2’nin ise %10,18 PHB verimine ulaştığını bildirmişlerdir.  Araştırmacılar,  düşük  maliyetli  PHB  üretimi  için  ucuz  karbon kaynaklarının kullanılabileceğini bildirmişlerdir.

Gouda ve arkadaşları, şeker kamışı melası ve mısır suyunu karbon ve nitrojen kaynağı olarak kullanarak B. megaterium ‘da PHB üretimini incelemişler ve en yüksek PHB  miktarının  melas  ve  glukoz  içeren  besiyerinde  elde  edildiğini  bildirmişlerdir. Araştırmacılar,  hücre  gelişiminin  en  iyi  olduğu  melas  yüzdesinin  %3  olmasına rağmen,  en  yüksek PHB  verimi olan %46,2’lik oranın %2 melas  içeren besiyerinde elde edildiğini bildirmişlerdir.

Hoffmann ve arkadaşları, çalışmalarında, glukonat veya asetat gibi basit karbon kaynaklarında  üretilirlerse,  çeşitli  Pseudomonas  bakterilerinin,  orta  zincir uzunluğunda,  3-hidroksi  yağ  asitlerinden  şekillenen  (C6-C14)  PHA  biriktirme yeteneğinde olduğunu belirtmişlerdir.

Ps.  aeruginosa,  Ps.  putida  ve  Ps.  fluorescens  gibi  diğer  florosan  Pseudomonas suşları  da,  karakteristik  bir  özellik  olarak  karbon  kaynakları  varlığında  ve  sınırlayıcı şartlar  altında  PHB  üretimi  yapmazlar.  Ancak,  Huisman  ve  arkadaşları,  yağ asitlerinde  üretilirlerse,  orta  zincir  uzunluğunda  (C6-C12)  PHA  üretebildiklerini göstermişlerdir.  Araştırmacılar,  polimer  oluşturma  yeteneğinin  plasmid  DNA’dan kaynaklanmadığını,  özel  bir  enzim  sisteminin  PHA  üretiminde  etkin  olduğunu belirtmişler  ve  PHB  üretmeme  özelliklerinin  bu  bakterilerin  sınıflanmasında kullanılabileceğini bildirmişlerdir.

Metilotrofik organizmalardan olan bazı Pseudomas  ‘ların da PHB üretimi araştırılmış ve  yüksek  verim  görülmüştür.  Ps.  oleovorans,  Ps.  aeroginosa, Ps. putida,  Ps. fluorescens  ve  Ps.  testotereni,  n-alkoller  ve  n-alkanoik  asitler  kullanılarak  PHB üretimi  gözlenmiştir.  Karaboz  ve  Umay,  Ps.  extorguens  bakterisini metanol içeren karbon kaynağında ürettiklerinde % 27 PHB üretimi saptamışlardır.

Fakültatif  metilotrof  Pseudomonas  sp.135  suşu  üzerinde  yapılan  bir  çalışmada methanol varlığında NH4’ün sınırlı  tutulduğu ortamda %55, Mg+2 eksikliğinde %42,5 ve PO3-4 eksikliğinde ise %34,5 PHB verimi sağlandığı tespit edilmiştir.

Xi ve arkadaşları, Ps. stutzeri 1317 suşunu glukoz, glukonat, yağ asidi ve alkol içeren ortamda yetiştirmişler ve PHA yapısının ortamdaki yağ asidi ve alkollere bağlı olarak değiştiğini  tespit etmişlerdir. Araştırıcılar, glukoz  içeren besiyerinde 20. saatte başlayan nitrojen eksikliğinin hem hücre  sayısı hem de polimer miktarında artmaya neden olduğunu ve %50 PHB verimine ulaştıklarını bildirmişlerdir.

Ateş  ve  Ekmekçi,  Pseudomonas  extorquens  DMS  1337  ve  Azotobacter chrococcum  (TEM)’in  pancar  melası  içeren  besi  ortamındaki  PHB  üretimini inceledikleri  araştırmalarında,  P.  extorquens  DSM  1337’nin  %22,98  ve  A. chrococcum (TEM)’in %12,10 PHB üretim verimine ulaştığını bildirmişlerdir.

Diğer Bakterilerde PHB Üretimi

Biyolojik  olarak  parçalanabilen  plastik  olan  PHA’ın  fotosentetik  üretimi  için,  güneş ışığı yardımıyla, sera etkisi yaratan gaz olan karbondioksitin kullanımı çevresel olarak kabul  edilebilir  olduğundan,  bu  iş  için  siyanobakterlerin  seçiminin  uygun  olduğu belirtilmiştir. Karbondioksitten PHA biriktiren üç grup mikroorganizma vardır ki bunlar, hidrojen  okside  eden  kemoototrofik  bakteriler,  genetik mühendisliği  ile  yükseltilmiş bitkiler ve siyanobakterlerdir. Bunlar oksijenik fotosentez ile PHA depo ederler. Asada ve arkadaşları, termofilik izolat Synechoccus MA19 suşu ile yaptıkları çalışmada, fotoototrofik  şartlarda  ve  nitrojen  azlığında  PHB  biriktirdiğini  ve  PHB  granüllerinin tilakoid membranla ilişkili olduğunu bildirmişlerdir.

Gomez  ve  arkadaşları,  toprak Gram  negatif  bakterilerinin  şeker  kamışı  türevli şekerler  olan  sükroz,  fruktoz  ve  glukoz  ile  propiyonik  asitten  PHB  üretimini incelemişler ve %50-80 arasında verime ulaşmışlardır.

Bitkide  nodül  oluşturan  toprak  bakterilerinden  olan  Rhizobium  cinsi  bakterilerin  de hücre içi PHB depo etme yeteneği birçok araştırmaya konu olmuştur. Bonartseva ve arkadaşlarının yaptığı  çalışmanın  sonuçlarına  göre,  PHB  içeriği,  nitrogenaz enzimi  aktivitesi  ile  ters,  hidrogenaz  enzimi  aktivitesi  ile  doğru  orantılıdır.  Yine,  R. leguminosarum, R. trifoli, R. galega, R. meliloti, R. phaseoli gibi farklı türlerle yapılan çalışmalarda da, PHB üretimlerinin suşa ve kültürel ortama bağlı olduğu bildirilmiştir. Sükroz  içeren  besiyerinde,  farklı  azot  kaynakları  kullanılarak  yapılan  çalışmada,  en yüksek  PHB  veriminin  KNO3’lı  besiyerinde  %65  ile  R.  phaseoli  ‘den  elde  edildiği bildirilmiştir.

Jan  ve  arkadaşları,  R.  meliloti  ‘de  ortamda  karbon  kaynağı  olduğunda  ve gelişme için gerekli nitrojen gibi elementler sınırlı tutulduğunda PHB’ın depo edildiğini bildirmişlerdir.  Karbon  kaynağı  tümüyle  kullanıldığında  ise  PHB  metabolize edilmektedir.  R.  meliloti  fruktozlu  ortamda  üretildiğinde  büyük  miktarda  PHB  depo etmektedir.

Tal  ve  Okon,  Azospirillum  brasiliense  Cd  suşunun,  eksponansiyel  fazın  son aşamasında,  yüksek  C/N  oranında,  oksijen  sınırlandırıldığında  %5  olan  PHB veriminin, %40’a ulaştığını bildirmişlerdir.

Brandl  ve  arkadaşları,  fotosentetik  bakteriler  olan  Rhodospirillum  ve Rhodobacter  cinsleri  üzerinde  yaptıkları  araştırmalarda  bunların  da  n-alkanoik asitlerden polimer depo ettiğini, ayrıca nitrojenin sınırlandırılması durumunda %PHB veriminin hücre kuru ağırlığının %60-%70’i kadar olabildiğini bildirmişlerdir.

Lillo  ve  Rodriguez-Valera  ise,  yüksek  tuz  konsantrasyonlarında  yaşayan halofilik  bakterilerden  olan  Halobacter  mediterranei  ‘nin,  karbon  kaynağı  olarak glukoz  ve  nişasta  kullanıldığında,  fosfatı  sınırlandırılmış  şartlar  altında  %60  PHB verimi elde edildiğini bildirmişlerdir.

Bunların  dışında  Laktik  asit  bakterilerinin  de  PHB  üretimi  için  kullanılabileceği bildirilmiştir. Lactobaciller sürekli fermentasyon şartlarında üretilseler, daha fazla PHB biriktirdikleri ve bunun  ticari  termoplastik üretiminde de kullanılabileceği söylenmiştir.

Qi  ve Rehm,  yaptıkları  çalışmada  en  büyük  PHB  sentaz  genini  tespit  ettikleri Caulobacter  crescentus  bakterisinin,  glukoz  varlığında  %18  PHB  ürettiğini  tespit etmişlerdir.Bu bakteri özelikle içerdiği PHB sentaz enzimi nedeniyle dikkat çekmiş ve genetik uygulamaya tabii tutulmuştur.

Manna ve arkadaşları, topraktan izole ettikleri 55 toprak streptomycet üzerinde yaptıkları çalışmada, Streptomyces griseorubiginosus olarak  tanımlanan  izolatın, %2 glukoz varlığında, durgun fazda, miselial kuru ağırlığının %9,5’u kadar PHB ürettiğini tespit etmişlerdir.

Semenov  ve  arkadaşları,  birkaç  polyprosthecate  bakterisi  ile  yaptıkları çalışmalarında,  Labrys  cinsinde  yeralan  bakterilerin  %26,  Prothecomicrobium cinsindeki bakterilerin ise %23 PHB miktarına ulaştıklarını bildirmişlerdir.

Aktif çamur bakterilerinde de PHB’ın varlığı rapor edilmiş ve PHB gibi bakteriyel depo polimerlerinin  önemi,  aktif  çamur  işlemlerinde  karbon  substrat  değişimlerinin anlaşılmasında  ayrıntılı  olarak  çalışılmıştır.  Mikrobiyal  oksidasyon  sırasında yapışkan,  topaklı  ve  gri-siyah  bir  yapı  olan  aktif  çamur,  mikrobiyal  hücre, heteropolisakkaritler ve polyester içerdiği bildirilmiştir.

Loosdrecht ve arkadaşları, aktif çamur  içindeki bakterilerin PHB depo ettiklerini ve  hücre  dışı  maddeler  tükendiğinde,  depolar  aracılığıyla  gelişmelerini sürdürdüklerini belirtmişlerdir.

Genetik Uygulamalarla PHB Eldesi

1920’li yıllardan bu yana hakkında birçok bilgi edinilmiş olmasına rağmen, ticari PHB üretiminin  hala  çok  yüksek  maliyete  neden  olması,  sentetik  polimerlerin  yerini alabilecek  kapasiteye  sahip  olan  bu  biyoplastiğin  en  önemli  dezavantajıdır.  Son yıllarda, moleküler  biyolojideki  gelişmelere  paralel  olarak,  daha  fazla  ve  ucuz PHB üreten rekombinant bakteriyel suşların ve transgenik bitlilerin geliştirilmesi çalışmaları hız kazanmıştır.

Rekombinant Mikroorganizmalardan PHB Üretimi

PHB’ın  rekombinant  mikroorganizmalardan  yüksek  oranda  üretimi,  vektör  veya promotor  aktivitesindeki  zenginleşmeye  bağlı  olarak  artmaktadır.  Bu amaçla Alcaligenes eutrophus  ve Alcaligenes  latus bakterilerinin PHB biyosentez genlerinin başarıyla  aktarıldığı  rekombinant  Escherichia  coli  suşları  kullanılmaktadır. Nitekim, 1987 yılında A. eutrophus genleri, E. coli bakterisine başarıyla klonlanmış ve normalde  PHB  üretmeyen  bakterinin,  modifiye  edildikten  sonra  PHB  ürettiği gösterilmiştir.

PHB  biyosentetik  genlerinin  (phbA,  phbB  ve  phbC)  Alcaligenes  eutrophus’da kromozom  ve  megaplasmid  pHG1’de  yerleştiği  bildirilmiştir.  Gelişen Hibridizasyon  teknikleri  ve  heterolog  tamamlayıcılar,  bu  ve  diğer  bakterilerin  PHB biyosentez genlerinin izolasyonunu ve klonlanmasını mümkün kılmaktadırlar.

E.coli, PHB üretimi  çalışmaları  için etkin olarak  kullanılabilen bir  konakçı  suş olup; sadece  çok  düşük  molekül  ağırlığa  sahip  granül  halde  olmayan  PHB  biriktirdiği bildirilmiştir.  Rekombinant  E.  coli’nin  PHB  üretimi  için  geliştirilmesinin  hızlı üreyerek,  gerekli  hücre  yoğunluğuna  ulaşması;  polimerin  yüksek  miktarda biriktirilebilmesi;  ucuz  karbon  kaynağı  kullanabilmesi,  üretilen  PHB’ın  kolay saflaştırılabilmesi  ve  sentezlenen  polimerin  depolimerizasyonuna  neden  olan enzimlerin eksikliği gibi önemli bazı avantajları vardır. Bu nedenle, rekombinant E.coli bakterilerinden  %80-90  oranında  PHB  verimi  elde  etmek  mümkün  olduğu bildirilmektedir.

Lee ve arkadaşları, E.coli’de PHB üretimi için, A. eutrophus PHB sentez genleri taşıyan plazmidler kullanmışlar ve plazmid stabilitesinin yüksek olduğunu belirttikleri çalışmalarında, PHB veriminin %80,1’e ulaştığını bildirmişlerdir. Peynir altı suyu gibi ucuz substratlardan PHB üretiminin, bir rekombinant E. coli suşu kullanılarak araştırıldığı bir çalışmada,  farklı oksijen konsantrasyonları altındaki PHB verimleri  araştırılmıştır.  Oksijen  sınırlamasının  PHB  verimini  arttırdığı  tespit  edilen araştırmada, yüzde PHB verimi %80’e ulaşmıştır. Araştırmacılar, rekombinant E. coli ‘de PHB  biyosentez  zamanı  ve  oksijen  sınırlandırılması  zamanının PHB  verimi  için önemli olduğunu belirtmişlerdir.

Klinke  ve  arkadaşları da,  şeker  veya  melas  gibi  ucuz  karbonhidrat kaynaklarından,  rekombinant E.  coli  yardımıyla PHA  üretimi  için alternatif  stratejiler yapılabileceğini  ve E  coli’nin  kısa  sürede  üreme, PHA’ın  kolayca saflaştırılabilmesi, polimeri  parçalayıcı  enzim  sisteminin  yokluğu  nedeniyle  dikkat  çektiğini söylemişlerdir.  Araştırmacılar,  β-oksidasyon  döngüsünü  işletemeyen  bir  E.coli suşuna, glukonattan PHA sentezleyemeyen Pseudomonas bakterisininden orta zincir uzunluğunda PHA polimeraz enzimini kodlayan geni aktararak, onun glukonattan orta zincir uzunluğunda PHA üretmesini  sağlamışlardır.  Rekombinant  E.  coli  ‘deki  PHA verimi %2,3 olarak tespit etmişlerdir.

Qi  ve Rehm, bilinen en büyük PHB  sentaz genine  sahip olduğunu bildirdikleri, glukoz  varlığında  %18  PHB  üreten, Caulobacter  crescentus  bakterisini  genetik uygulamaya tabii tutmuşlardır. Bakterideki PHB sentaz enzimi genini, phaC, kodlayan bölgeyi mutant A. eutrophus PHB(-)4 ve recombinant E. coli JM109’a aktarmışlardır. Sonuçta  yüzde  PHB  verimi  sırasıyla %62  ve %6  olarak  tespit  edilmiş,  özellikle  A.eutrophus PHB(-)4’den alınan verim dikkate değer görülmüştür.

Ahn ve arkadaşlarının, Alcaligenes latus PHA biyosentez genlerini kopyaladıkları E.  coli  CGSC  4401  suşunun,  peynir  altı  suyundan  ürettiği  PHB  miktarını  tespit ettikleri çalışmalarında, yüzde PHB veriminin yaklaşık %60 civarında olduğunu tespit etmişlerdir.  Araştırmacılar,  farklı  oranlardaki  çözünmüş  oksijen  konsantrasyonunun etkisini  de  inceledikleri  araştırmalarının  sonucunda,  mikroorganizmanın  aktif  PHB sentez  fazını geçirdiği  sırada  çözünmüş oksijen  konsantrasyonunun düşürülmesinin PHB sentezini hızla arttırdığını bildirmişlerdir.

Slater  ve  arkadaşları yaptıkları  çalışmada,  A.  eutrophus  ‘dan  alınan  PHB biyosentez  genlerini  E.  coli  fadR  atoC  mutant  bakterisine  aktararak,  glukoz  ve propiyonat  içeren  ortamda  P(HB-co-HV)  kopolimerinin  üretilmesini  sağlamışlar  ve özellikle  ortamdaki  propiyonat  miktarının  HV  şekillenmesinin  oranını  değiştirdiğini tespit etmişlerdir.

Föllner  ve  arkadaşları,  metanol  içeren  ve  nitrojen  ve  fosforu  sınırlandırılmış ortamda, çok az miktarda PHB biriktiren Mycoplana rubra B346 suşuna PHA sentez enzimi  genlerini  aktarmışlar  ve  PHB  birikimini  %9,6’den  %25’e  yükseldiğini bildirmişlerdir.

Hori  ve  arkadaşları, Bacillus megaterium  ‘un  kendini  yıkan  bir  suşu  üzerinde yaptıkları  çalışmalarla  elde  ettikleri  transformantın  PHB  üretimini  incelemişler  ve ortamda glukoz tükenince hücrelerin kendiliğinden parçalanıp, PHB’ın serbestleştiğini tespit etmişlerdir.

Transgenik Bitkilerden Biyoplastik Eldesi

Bitkiler  birer  PHB  üreticisi  olmamalarına  karşın,  PHB  genlerinin  taşıyıcısı olabildiklerinden,  PHB  üretebildikleri  ve  bu  nedenle,  transgenik  bitkilerin  çok miktarda ve ucuz PHB üretimi için potansiyel organizmalar olduğu bildirilmiştir. Yapılan  çalışmalarda bunlardan,  kuru ağırlıklarının %20-40 arasında PHB elde edilebilmiştir.

Bitkilerde  biyoplastik  sentezinin  değişik metabolik  yollarla,  sitoplazma,  plastid  veya peroksizomda  gerçekleşebildiği  bildirilmektedir.  Araştırmacılar,  gen  aktarımı yapılmış bitkilerin, PHB üretimine başladıktan sonra nişasta üretimini bıraktıklarını ve tüm  enerjilerini  polimer  yapımı  için  yönlendirdiklerini  söylemektedirler.  Bunun,  yeni enzimlerin  eklenmesi  ve  varolan  enzimlerin  çalışmasının  engellenmesi  ile  ortaya çıktığını düşünen bilim adamları, PHB’ı metabolize edemeyen bitkilerin  tohumlarının gelişememesini ise bir problem olarak belirtmektedirler.

Alcaligenes eutrophus ‘dan alınan PHB genleri, mısır, patates gibi birkaç farklı bitkiye aktarılarak, onların polimer üretmesi sağlanabildiği ve  Imperial Kimya Şirketi’nin pilot uygulamalarında yılda 50 ton PHB-HV kopolimerinin elde edilebildiği bildirilmiştir. Mısır ve arpa yağlı  tohumlarında, ayçiçeği ve soya  fasulyesinde PHA’ların üretilmesi için büyük şirketler tarafından araştırmalara devam edilmektedir.

Bitkilerden  PHB  eldesinde  tüm  fermentasyon  işlemlerinin  ortadan  kalktığını  ve plastiğin  direkt  olarak  elde  edilebildiğini  bildiren  araştırmacılar,  genetik  olarak değiştirilmiş  mısır  bitkisine  sentez  ettirilen  plastiğin,  bitkinin  çok  fazla  büyümeden hasat edilmesi ile elde edildiğini rapor etmişlerdir.

Modifiye mısırdan PHA eldesinin ise, oldukça sert ve ağır bir işlem gerektirdiği ancak karbondioksit ve güneş ışığının, karbon ve enerji kaynağı olduğu bu PHA üretiminde yapılması  gerekenlerin,  fermentasyon  işlemlerinden  daha  fazla  olmadığı söylenmektedir.

Bitkilere  PHA  genlerinin  aktarılması  ile  ilgili  ilk  araştırmalarda,  A.  eutrophus bitkisinden alınan genlerin aktarıldığı bitki, Arabidopsis  thaliana olmuştur. Poirier,  A.  thaliana  sitoplazmasında,  A.  eutrophus’un  PHA  sentaz  ve  asetoasetil-CoA redüktaz  genlerinin  etkinlik  gösterdiğini  rapor  etmişlerdir.  3-ketotiolaz  geni  bitki sitoplazmasında  mevcuttur.  Bu  deneyler,  tüm  bitki  dokularının  koful,  çekirdek  ve sitoplazmalarında  PHB  sentezinin  olduğunu  fakat,  düşük  miktarda  ve  zayıf  tohum gelişimine sebep olduğunu göstermiştir.

Daha  sonraki  araştırmalar,  asetil-CoA’dan  trigliseridlerin  oluştuğu  yer  olan,  plastid gibi özel organellerde PHB üretilme yöntemlerinin geliştirilmesine yönlendirilmiştir. Bu çalışmalarla,  sitoplazmada  depolanan  PHB’den  100  kez  daha  fazla,  bitkinin  kuru ağırlığının  %14’ü  kadar  homopolimer  elde  edilmiştir  ve  PHB  granüllerin  şekli  ve büyüklüğü, bakteriyel granüllere benzemektedir. A.  eutrophus’un  PHA  sentaz  ve  asetoasetil-CoA  redüktaz  genlerinin  aktarıldığı pamuk  bitkisinde  de,  pamuk  liflerinin  PHA  içerdiği  ve  bu  liflerin  yüksek  ısıya  daha dayanıklı hale geldiği bildirilmiştir.

Şimdiye  dek  yapılan  çalışmalar,  PHB  üretiminin  transgenik  bitkiler  ile ucuzlatılabileceğini göstermektedir ki bu gelecekte marketlerde  “plastik patatesler”le karşılaşabileceğimizi düşündürmektedir.

Araştırmalarda elde edilen sonuçlardan, PHB üretiminin mikroorganizmaların türüne, üretim şartlarına ve  rekombinasyonların başarısına bağlı olarak değişiklik gösterdiği tespit  edilmiştir.  Gelecek  yıllarda  PHB  polimerinin,  geniş  kullanım  alanlarına sunulabilecek düzeyde üretiminin büyük faydalar getireceği açıktır.